一种利用赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）冷冻电镜（cryo-EM）和Schrödinger 平台实现的快速“从基因到药物”研究方法

引言

基于结构的药物设计（SBDD）为基于靶点 的小分子药物^发现带来了成本效益、时效性及优异的药理特性¹⁻³。如今，计算方法 已发展到能够对配体的亲和力^⁴和 选择性^⁵进行定量预测的程度。 从历史上看，X射线晶体学一直推动着基于结构的药物发现（SBDD）的发展，从而开发出了用于治疗包括^{艾滋病⁶和癌症²}在内的多种疾病的强效且选择性高的蛋白酶和激酶抑制剂。然而，许多在药物学上重要的靶点，如大型大分子复合物或膜蛋白，由于缺乏三维结构信息，不太适合采用SBDD方法。 近年来，蛋白质制备和冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术的进步，拓展了SBDD在这些^{关键靶点中的}应用^{范围⁷,⁸}。本文介绍了赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific）和Schrödinger 研究团队采用的方法，该方法部署了GeneArt Gene-to-Protein、Thermo Scientific iSPA工作流以及Schrödinger 药物发现平台。

靶点 选择

启动药物发现项目的靶点选择，取决于对未满足医疗需求的理解，以及来自临床、遗传学和临床前研究的多重证据，这些证据可揭示其治疗潜力（图1）。以生化、药理学和遗传学数据形式呈现的生物学依据——这些数据将靶点 活性的调节与病理生理学及疾病机制联系起来——是关键因素。 例如，在临床前模型和人类研究中，基因型与表型之间存在明确关联的靶点被视为优先级更高的目标。确认抑制或激活的影响以及对可治疗性的理解，也是靶点 验证的重要方面，这些因素是启动项目的重要触发因素。

所有靶点都必须支持SBDD建模。在对特定靶点 的现有临床和临床前项目进行仔细审查后，将确定哪些挑战可通过Schrödinger的计算平台解决。首先使用Schrödinger 平台分析蛋白质结构质量和结合位点 成药性，随后评估这些结构是否适合应用该技术。 由于缺乏高质量的结构数据，大量符合生物学合理性和治疗潜力标准且极具研究价值的靶点，在获得高分辨率结构之前，需要重新排序优先级。这通常是因为此类靶点属于膜蛋白，或是形成大型多聚体结构的蛋白质，而这类结构往往难以通过X射线晶体学进行解析。 幸运的是，此类靶点通常非常适合通过冷冻电镜（cryo-EM）进行结构测定，从而能够对以往无法测定的靶点进行建模。在对生物学依据、未满足的医疗需求以及冷冻电镜技术对靶点 的潜在支持能力进行仔细分析后，选定了一个靶点 作为合作对象。

蛋白质生产

一旦选定了靶点 ，需要克服的首要难关就是制备出质量符合冷冻电镜（cryo-EM）要求的蛋白质。 冷冻电镜通常适用于分子量超过50 kDa的多聚体和/或膜蛋白复合物。这给蛋白质的制备和纯化带来了挑战，特别是在药物发现的时间预期范围内。赛默飞世尔科技的GeneArt平台包含一项“基因到蛋白质”服务，该服务仅需提供蛋白质序列，即可涵盖从基因合成到蛋白质纯化的每个步骤（图2）。

在本项目中，研究流程包括基因优化 、DNA合成以及在Gibco Expi293细胞中进行瞬时蛋白表达。通过末端His标签从细胞质分馏物中纯化所得的蛋白质纯度极高，无需进一步纯化。从基因测序到纯化蛋白的整个工作流程在6周内完成。 所得蛋白浓度为5 mg/ml，足以生成含有大量颗粒的密集显微图像以供后续分析；其产率超过10 mg，完全能够满足基于冷冻电镜的结构测定流程数月的需求。

冷冻电镜结构测定

为了确定我们选定的靶点 的结构，我们采用了Thermo Scientific iSPA工作流程——这是一种用于药物发现的商用单颗粒分析（SPA）解决方案。该工作流程包含一台Thermo Scientific Vitrobot Mark IV设备，用于制备玻璃化冷冻电镜样品，该设备可在涂布蛋白质溶液并进行吸干后，将多孔碳网快速浸入液态乙烷中进行玻璃化冷冻。 此过程可将蛋白质包埋于一层非晶态冰中，从而保留其在溶液中的天然状态。随后，这些样品在赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）Krios Rx冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）上进行冷冻电镜数据采集。Krios Rx由赛默飞世尔科技EPU软件控制，该数据采集软件支持自动筛选 以及跨多个网格的数据采集（得益于EPU最近推出的Multigrid功能）。 Krios Rx 会录制代表目标靶点 的二维投影图像的动态视频，这些视频随后用于计算三维图像重建。数据采集完成后，三维重建过程涉及对数十万张孤立颗粒的二维图像进行定向和平均处理，从而计算出蛋白质的高分辨率结构图谱。EPU Quality Monitor 和 EPU Data Management（由 Thermo Scientific Athena 软件提供支持）确保了最佳的数据质量和数据流。

在本研究中，iSPA工作流程轻松地为无配体和有配体的复合物均获得了约2.5 Å分辨率的结构重建（图3）。该靶点 的初始结构解析工作从收到蛋白质起耗时两周，期间进行了两次成像尝试。第一次尝试中，蛋白质以0.5 mg/ml的浓度冷冻，但未能成功。 冷冻电镜（Cryo-EM）筛选 显示颗粒分布不均，仅出现在碳膜区域或靠近碳膜孔洞边缘的位置。鉴于高颗粒密度通常有利于玻璃化，GeneArt提供了第二批浓度更高的蛋白质（5 mg/ml），这使得网格上的颗粒呈现出均匀且高密度的“单层”分布。 目标化合物先溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，并在玻璃化前加入蛋白质溶液，力求最终化合物和DMSO的浓度分别达到约50 μM和约0.5%。 针对每个数据集，我们采集了约五千段动态影像，并使用运行于低成本四路GPU工作站上的Relion^39软件进行重建。从样品制备到首个复合物结构的高分辨率重建，整个过程总共耗时3天，且能够在类似的时间范围内解析出其他配体结合结构。

图3。左图所示的赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）Krios Rx Cryo-TEM高端显微镜是首款专为制药行业设计的冷冻电镜（cryo-EM）结构基于设计（SBDD）解决方案，其高通量性能得到保证，非常适合迭代结构测定。右图展示了4个代表性残基的细节，显示了根据电镜数据集重建的库仑势以及拟合模型。如图所示，这些数据足以确定大多数侧链的位置。

 

基于结构的药物设计

获得蛋白质-配体复合物结构后，使用Schrödinger 平台构建了原子模型，并将其导入Schrödinger 的SBDD处理流程。在此过程中，利用GlideEM工具对配体进行定位——该工具结合了基于分子力学的分子对接 算法与实空间交叉相关性，将配体定位到冷冻电镜^图中¹⁰。 随后，利用Phenix/OPLS3e（OPLS4的前一版本）对生成的原子模型进行了精修。该软件结合了最先进的实空间精修技术、先进的Schrödinger 力场以及隐式溶剂模型，能够捕捉蛋白质-配体系统背后的物理机制。该工作流程能够快速构建出既与冷冻电镜数据一致，又符合系统物理规律的稳健原子模型。

随后，这些原子模型可在Schrödinger 的SBDD工作流中得到应用，用于对海量多样化的化合物进行虚拟筛选。此外，还可以设计针对性的计算筛选方案，以消除已知的缺陷，或利用机会使某一系列化合物在竞争化合物中脱颖而出。在此案例中，我们利用经过优化的原子模型 FEP+ ，构建了一个亲和力 预测模型，并通过回溯预测先前已获专利的62种同系物系列在亲和力 方面的差异，对该模型进行了验证。我们成功捕捉到了几个主要的亲和力 陡坡，从而验证了这些优化后的原子模型质量足够高，可作为SBDD主导项目的一部分用于前瞻性设计（图4）。 我们利用这一经过验证的亲和力 模型，探索对化合物的修饰方案，以满足项目团队确定的靶点 产品特征目标，例如新颖性、提高渗透性以及消除潜在反应性基团，同时保持药效。利用Pathfinder软件构思有前景的化合物， Glide 用于生成潜在构象， FEP+ 结合我们经过验证的亲和力 模型对化合物效力进行评分。在获得靶点-配体复合物的冷冻电镜结构后的几周内，便利用基于结构的计算方法对化合物进行了合成优先级排序。

结论

通过综合运用赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）的GeneArt基因到蛋白质解决方案、Thermo Scientific iSPA工作流程（Thermo Scientific Cryo-EM）以及Schrödinger 药物发现平台，该团队在两个月内完成了药物靶点 的结构解析，并在短短几周后便设计出了新型的计算机辅助设计化合物（图5）。 这清楚地表明，冷冻电镜与计算化学方法的结合能够构建一条对药物发现项目产生重大影响的工作流程。