Thermo Scientific Cryo-EM 및 Schrödinger 플랫폼을 활용한 신속한 유전자-약물 개발 접근법

서론

구조 기반^{약물 설계}(SBDD, Structure- 약물 설계 )^는 표적 기반 소분자 신약^개발1-3에 비용 효율성, 신속성 및 우수한 물성을 부여합니다. 오늘날, 전산적 접근법은 리간드^{친화도4와선택성5에} 대한 정량적 예측을 제공할 수 있을 정도로 발전했습니다. 역사적으로 X선 결정학은 SBDD 연구를 주도해 왔으며, 그 결과^AIDS⁶및^암²을 비롯한 다양한 질병 치료를 위한 강력하고 선택적인 프로테아제 및 키나제 억제제가 개발되었다. 그러나 대형 고분자 복합체나 막 단백질과 같이 약학적으로 중요한 많은 표적들은 3차원 구조 정보가 부족하여 SBDD에 적용하기 어렵다. 최근 단백질 생산 및 극저온 전자 현미경(cryo-EM) 분야의 발전으로 인해, 이러한 중요한^표적에 대한 SBDD의 역할이 확대^{되었습니다⁷,⁸}. 본 글에서는GeneArt Gene-to-Protein,Thermo Scientific iSPA 워크플로우및Schrödinger 신약 개발 플랫폼을 도입한 Thermo Fisher Scientific과 Schrödinger 연구팀이 채택한 접근 방식을 소개합니다.

표적 선정

신약 개발 프로그램의 시작을 위한 표적 선정은 미충족 의료 수요에 대한 이해와, 치료 잠재력을 뒷받침하는 임상, 유전학적 및 전임상 연구에서 도출된 다양한 증거에 달려 있습니다(그림 1). 표적 활성의 조절을 병리생리학 및 질병 기전과 연결 짓는 생화학적, 약리학적, 유전학적 데이터 형태의 생물학적 근거가 핵심 요소입니다. 예를 들어, 전임상 모델 및 인간 연구에서 유전자형과 표현형 간의 관계가 명확하게 규명된 표적은 우선순위가 더 높은 것으로 간주됩니다. 억제 또는 활성화의 영향을 확인하고 치료 가능성을 파악하는 것 또한 표적 검증의 중요한 측면이며, 이는 프로그램 개시의 계기가 됩니다.

SBDD를 적용하려면 모든 표적에 대해 모델링이 가능해야 합니다.특정 표적에 대한 현재의 임상 및 전임상 프로그램을 면밀히 검토한 후, ‘ Schrödinger’의 전산 플랫폼을 통해 해결할 수 있는 과제를 파악합니다. ‘ Schrödinger ’ 플랫폼을 사용하여 단백질 구조의 품질과 결합 부위의 약물 개발 가능성을 분석한 다음, 해당 구조가 해당 기술에 활용하기에 적합한지 여부를 평가합니다. 고품질 구조 데이터가 부족하기 때문에, 생물학적 타당성과 치료적 잠재력 기준을 충족하는 매우 흥미로운 표적들 중 상당수는 고해상도 구조가 확보될 때까지 우선순위를 재조정해야 할 필요가 있습니다. 이는 종종 해당 표적이 막 단백질이거나, X선 결정학 분석에 어려움을 주는 거대한 다량체 구조를 형성하는 단백질이기 때문입니다. 다행히도 이러한 유형의 표적은 종종 극저온 전자현미경(cryo-EM)을 통한 구조 규명에 매우 적합하며, 이전에는 접근할 수 없었던 표적의 모델링도 가능하게 합니다.생물학적 타당성, 미충족 의료 수요, 그리고 해당 표적에 대한 극저온 전자현미경 활용 가능성을 신중하게 분석한 끝에, 협력을 위한 표적이 선정되었습니다.

단백질 생산

표적 단백질이 선정되면, 극복해야 할 첫 번째 과제는 극저온 전자현미경(cryo-EM) 분석에 사용할 수 있는 적절한 품질의 단백질을 생산하는 것입니다. 크라이오-EM은 일반적으로 분자량이 50 kDa 이상인 다량체 및/또는 막 단백질 복합체에 적용됩니다. 이는 특히 신약 개발의 예상 일정 내에서 단백질 생산 및 정제에 어려움을 초래합니다. 써모 피셔(Thermo Fisher)의 GeneArt 플랫폼은 단백질 서열만 있으면 되는 ‘Gene-to-Protein’ 서비스를 포함하며, 유전자 합성부터 단백질 정제에 이르는 모든 단계를 포괄합니다(그림 2).

이 프로젝트에서는 유전자 최적화, DNA 합성, 그리고 Gibco Expi293 세포를 이용한 일시적 단백질 발현 과정이 포함되었습니다. 말단 His 태그를 통해 세포질 분획에서 단백질을 정제한 결과, 순도가 매우 높고 추가 정제가 필요 없는 단백질을 얻었습니다.유전자 서열부터 정제된 단백질에 이르는 전체 워크플로는 6주 이내에 완료되었습니다. 이 단백질은 5mg/ml의 농도로 얻어졌으며, 이는 후속 분석을 위해 입자가 많은 고밀도 현미경 사진을 생성하기에 충분한 농도였으며, 수율은 10mg을 초과하여 수개월 동안 극저온 전자현미경(cryo-EM) 기반 구조 규명 파이프라인에 공급하기에 충분한 양이었습니다.

저온 전자현미경(Cryo-EM)을 이용한 구조 규명

선정된 표적의 구조 규명을 위해, 우리는 신약 개발을 위한 상용 단일 입자 분석(SPA) 솔루션인 Thermo Scientific iSPA 워크플로우를 사용했습니다. 이 솔루션에는 유리화 냉동 전자현미경(cryo-EM) 시료 준비를 위한Thermo Scientific Vitrobot Mark IV장치가 포함되어 있으며, 이 장치는 단백질 용액을 도포하고 닦아낸 후 액체 에탄 속에서 홀리 카본 그리드를 신속하게 침지 냉동할 수 있게 해줍니다. 이를 통해 단백질을 비결정질 얼음의 얇은 층에 매립함으로써 용액 내의 천연 상태를 보존할 수 있습니다. 그런 다음 시료는Thermo Scientific Krios Rx 극저온 투과전자현미경(cryo-TEM)을 사용하여 극저온 전자현미경(cryo-EM) 데이터 수집 과정을 거칩니다. Krios Rx는Thermo Scientific EPU와 연동되어 작동하며,EPU는 최근 추가된 EPU Multigrid 기능 덕분에 여러 그리드에 걸쳐 자동 스크리닝 및 데이터 수집을 가능하게 하는 데이터 수집 소프트웨어입니다. Krios Rx는 관심 대상의 2D 투영 이미지를 나타내는 동영상을 기록하며, 이 동영상은 이후 전산적 3D 이미지 재구성에 사용됩니다. 데이터 수집 후, 3D 재구성 과정에서는 분리된 입자의 수십만 장에 달하는 2D 이미지를 정렬하고 평균화하여 단백질의 고해상도 맵을 계산합니다. EPU Quality Monitor와 EPU Data Management(Thermo Scientific Athena Software 기반)는 최적의 데이터 품질과 데이터 흐름을 보장합니다.

본 연구에서 iSPA 워크플로는 리간드가 결합되지 않은 복합체와 리간드가 결합된 복합체 모두에 대해 약 2.5 Å의 분해능을 가진 재구성 구조를 손쉽게 도출해 냈다(그림 3). 이 표적에 대한 초기 구조 규명에는 단백질 수령 후 2주가 소요되었으며, 두 차례의 이미징 시도가 이루어졌다. 단백질을 0.5 mg/ml 농도로 동결시킨 첫 번째 시도는 성공하지 못했다. 저온 전자현미경(Cryo-EM) 스크리닝 결과, 입자가 고르지 않게 분포되어 있었으며, 탄소 영역이나 탄소 필름 구멍 가장자리 근처에서만 발견되었다. 일반적으로 높은 입자 밀도가 유리화(vitrification)에 유리하기 때문에, GeneArt는 더 높은 농도(5 mg/ml)의 단백질 두 번째 배치를 제공하였고, 그 결과 그리드 위에서 입자가 균일하고 매우 고밀도인 “단일층” 형태로 분포되었다. 관심 화합물들은 DMSO에 용해된 후 유리화 과정 전에 단백질 용액에 첨가되었으며, 최종 화합물 및 DMSO 농도를 각각 약 50 μM 및 약 0.5%로 맞추는 것을 목표로 했습니다. 각 데이터셋에 대해 약 5,000개의 동영상을 수집했으며, 저비용 쿼드 GPU 워크스테이션에서 구동되는 Relion^39를 사용하여 재구성을수행했습니다. 전체적으로, 시료 준비부터 첫 번째 복합체 구조의 고해상도 재구성에 이르기까지 소요된 시간은 3일 이내였으며, 유사한 시간 내에 추가적인 리간드 결합 구조를 해결할 수 있었습니다.

그림 3. 왼쪽은 Thermo Scientific Krios Rx Cryo-TEM 고성능 현미경으로, 반복적인 구조 규명에 이상적인 높은 처리량을 보장하는, 제약 산업 전용 최초의 극저온 전자현미경(cryo-EM) 기반 SBDD 솔루션입니다. 오른쪽은 EM 데이터 수집을 통해 재구성된 쿨롱 전위와 적합된 모델을 보여주는 4개의 대표적인 잔기 세부 모습입니다. 보시다시피, 이 데이터만으로도 대부분의 측쇄 위치를 확인하기에 충분했습니다.

 

구조 기반 신약 개발

단백질-리간드 복합체 구조를 확보한 후, Schrödinger 플랫폼을 사용하여 원자 모델을 생성하고 이를 Schrödinger SBDD 파이프라인으로 전달했습니다. 이 과정의 일환으로, 분자 역학 기반 도킹과 실공간 상호상관 분석을 결합하여 리간드를 극저온 전자현미경(cryo-EM^{) 맵에} 배치하는 도구인 GlideEM을 사용하여 리간드를 배치했습니다10. 그 결과 얻어진 원자 모델은 Phenix/OPLS3e(OPLS4의 이전 버전)를 사용하여 정제되었는데, 이 도구는 최첨단 실공간 정제 기술과 단백질-리간드 시스템의 근본적인 물리적 특성을 포착할 수 있는 고급 Schrödinger 힘장 및 암시적 용매 모델을 결합한 것입니다. 이 워크플로는 극저온 전자현미경 데이터와 시스템의 물리적 특성 모두와 일관성을 갖는 견고한 원자 모델을 신속하게 생성할 수 있습니다.

이러한 원자 모델은 ‘ Schrödinger ’ SBDD 파이프라인 내에서 활용하여 방대한 수의 다양한 화합물을 가상으로 스크리닝할 수 있습니다. 또한, 알려진 단점을 제거하거나 경쟁사 화합물과 차별화할 기회를 활용하기 위해 표적화된 전산 스크리닝을 설계할 수 있습니다. 이 경우, 우리는 정제된 원자 모델을 사용하여 FEP+ 정제된 원자 모델을 사용하여 친화도 예측 모델을 구축했으며, 이 모델은 이전에 특허를 받은 62개 화합물로 구성된 동족 계열에 대한 친화도 차이를 소급적으로 예측함으로써 검증되었습니다. 우리는 몇 가지 주요 친화도 급감 현상을 포착할 수 있었으며, 이를 통해 정제된 원자 모델이 SBDD 주도 프로그램의 일환으로 전향적 설계에 사용될 수 있을 만큼 충분히 높은 품질을 갖추고 있음을 입증했습니다(그림 4). 우리는 이 검증된 친화도 모델을 활용하여, 효능을 유지하면서 프로젝트 팀이 제시한 목표 제품 프로파일(예: 신규성, 투과성 향상, 잠재적 반응성 기단의 제거 등)을 달성하기 위한 화합물 수정을 탐구했습니다. Pathfinder를 사용하여 유망한 화합물을 구상하고, Glide 잠재적 포즈를 생성하는 데 사용되었으며, FEP+ 검증된 친화도 모델을 활용하여 효능을 평가했습니다. 표적-리간드 복합체의 극저온 전자현미경(cryo-EM) 구조를 확보한 지 몇 주 만에, 구조 기반 계산 방법을 사용하여 합성할 화합물의 우선순위를 정했습니다.

결론

연구팀은 Thermo Fisher의GeneArt Gene-to-Protein,Thermo Scientific iSPA 워크플로우(Thermo Scientific Cryo-EM), 그리고Schrödinger 신약 개발 플랫폼의 솔루션을 결합하여, 2개월 만에 약물 표적의 구조 규명을 완료하고, 불과 몇 주 후에 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 설계된 새로운 화합물을 도출해 낼 수 있었습니다(그림 5). 이는 크라이오-EM과 전산 화학 기법을 결합하면 신약 개발 프로젝트에 중대한 영향을 미칠 수 있는 파이프라인을 구축할 수 있음을 분명히 보여준다.